植物總蛋白提取試劑盒-通用型
Plant Total Protein Isolation Kit（for general use）
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTD8103
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植物總蛋白提取試劑盒-通用型
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20 次
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● 產(chǎn)品組成：
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序號
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產(chǎn)品貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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運輸
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1
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RTD8103-01
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試劑A-樣本雜質(zhì)去除劑
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20 ml
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4℃
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常溫
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2
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RTD8103-02
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試劑B-植物蛋白提取緩沖液II
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15 ml
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4℃
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3
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RTD8103-03
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試劑C-蛋白純化劑
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15 ml
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4℃ 避光
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4
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RTD8103-05
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溶液E-蛋白沉淀劑
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40 ml
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常溫(配制后4℃)
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5
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RTD8103-04
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試劑D-漂洗緩沖液
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10 ml
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-20℃
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濕冰
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6
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DT0140P-01
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1M DTT
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1 ml
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4℃ (配制后-20℃)
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7
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PC2030-03
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蛋白酶抑制劑混合物（100×,植物樣品用）
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0.2 ml
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-20℃
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8
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PL080-01
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5×MonoClolor 蛋白上樣緩沖液(變性，還原)
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1 ml
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-20℃
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9
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說明書
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● 產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品能夠有效裂解各種植物器官（如葉片，根，莖，果實，種子，花），去除各種植物樣品（包括富含次生代謝物質(zhì)和多糖多酚的植物）中常見的污染，如多糖，多酚，脂類，色素，次生代謝物等，得到的高純度蛋白樣品，可以用于SDS-PAGE凝膠電泳，Western印跡分析以及雙向電泳（2D電泳）。
該試劑盒含有除丙酮外的其他所有試劑，使用方便，能在3小時內(nèi)得到高純度的蛋白樣品。
按照每次提取使用0.7ml試劑B計算，該試劑盒可以至少使用20次。
● 使用方法：
實驗準備材料：
液氮；研缽；1.5ml離心管；一次性注射器；丙酮；80%丙酮；70℃水浴鍋；干浴器；冷凍離心機；制冰機；渦旋振蕩器。
一. 樣品破碎：
1.1
取植物樣本，在液氮條件下，用研缽充分研磨成粉末。
關(guān)鍵步驟：此步驟非常重要，樣本研磨越細越好，研磨不徹底會導致蛋白濃度偏低。
二. 沉淀雜質(zhì)：
2.1
取1.5 ml離心管，加入1
ml即用型試劑A（按照下表配制），迅速將約0.1克粉末加入其中，漩渦混勻，RT
放置5分鐘。
關(guān)鍵步驟：樣品粉末量不能超過0.1克，否則將導致蛋白提取得率和純度大大降低。
即用型試劑A-樣本雜質(zhì)去除劑配制
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即用型試劑A
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1個樣品
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2個樣品
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n個樣品
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試劑A-樣本雜質(zhì)去除劑
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0.5 ml
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1 ml
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n×0.5
ml
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丙酮
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0.5 ml
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1 ml
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n×0.5
ml
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1M
DTT
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10 μl
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20 μl
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n×10
μl
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2.212000g4℃離心5分鐘，去除上清，保留沉淀。
注：觀察沉淀顏色，如沉淀顏色為綠色，繼續(xù)步驟2.3；如沉淀顏色為淺色或白色，直接進行步驟2.4。
2.3
沉淀中加入1 ml即用型試劑A，漩渦混勻，RT放置5分鐘，12000g4℃離心5分鐘。
2.4
沉淀中加入1 ml 預冷的丙酮（自備，試劑盒不提供）和10
μl DTT溶液，漩渦震蕩（此時溶液狀態(tài)應為白色懸液），徹底重懸，12000g4℃離心5分鐘，去除上清，收集沉淀。
2.5
快甩離心數(shù)秒，殘留上清用移液器徹底吸棄，沉淀物通風晾干1-2分鐘至沉淀干燥。
關(guān)鍵步驟：沉淀不能過分干燥，否則會影響以下步驟蛋白的溶解性。
三. 蛋白粗提：
3.1
蛋白沉淀中加入0.7 ml 即用型試劑B（按照下表配制），漩渦震蕩，徹底重懸沉淀（此時溶液狀態(tài)為淡藍色的懸浮溶液）；70℃水浴1小時，間歇混勻。
即用型試劑B-植物蛋白提取緩沖液配制：
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即用型試劑B
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試劑B-植物蛋白提取緩沖液II
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0.7 ml
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5 ml
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10 ml
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蛋白酶抑制劑混合物（100×）
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7 μl
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50 μl
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100 μl
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1M
DTT
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7 μl
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50 μl
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100 μl
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3.212000g4℃離心10分鐘，小心取上清（通?？扇?00
μl，溶液為淡藍色）于1.5ml離心管中，不要吸取沉淀。
注：此步驟得到的蛋白溶液可以進行大多數(shù)蛋白實驗，如WB。如要進行雙向電泳（2D電泳）實驗，繼續(xù)以下步驟。
四. 蛋白純化：
4.1
加入與上清等體積的試劑C（注：試劑C上層為保護相，應該吸取下部的淡黃色液體），劇烈顛倒震蕩后常溫放置1-2分鐘，12000gRT 離心5分鐘，溶液分成兩層，上層溶液為藍色，蛋白位于下層溶液中。
注：試劑C有腐蝕性，請在通風櫥內(nèi)操作，注意防護。
4.2
用一次性注射器小心吸取下層溶液（通?？扇?50 μl）于1.5
ml離心管中，加入等體積試劑D，劇烈顛倒混勻，12000gRT 離心5分鐘，蛋白位于上層溶液中，收集上層溶液（通?？扇?50-200
μl）于1.5ml離心管中。
五. 蛋白沉淀：
5.1
蛋白溶液中加入5倍體積溶液E（注意是否已經(jīng)按照標簽所示加入甲醇），顛倒混勻，此時可見有絮狀沉淀生產(chǎn)，-20℃ 沉淀30分鐘。
注：微量蛋白的提取可以-20℃過夜沉淀。
5.212000g4℃離心10分鐘，收集蛋白沉淀，去除上清。
注：正常的蛋白沉淀接近無色，如顏色為褐色或淡黃色說明蛋白不純，不能用于雙向電泳實驗。重復步驟3.1-5.2，直至蛋白沉淀接近無色。
5.3
沉淀中加入1ml 溶液E（注意是否已經(jīng)按照標簽所示加入甲醇），徹底重懸沉淀，12000rpm4℃離心5分鐘，棄上清。
5.4
沉淀中加入1ml預冷的80%丙酮（自備，試劑盒不提供）和10
μl DTT，徹底重懸沉淀，12000g4℃離心5分鐘，棄上清。
5.5
快甩離心數(shù)秒，殘留上清移液器徹底吸棄，沉淀物通風晾干1-2分鐘至沉淀干燥。
關(guān)鍵步驟：沉淀不能過分干燥，否則不好溶解。
六. 蛋白溶解：
6.1
沉淀中溶解于適量PBS溶液或者適當體積樣品緩沖液溶解，-20℃或-80℃貯存。
注： ① 如進行雙向電泳，樣品溶于雙向電泳樣品緩沖液中；如進行單向電泳，樣品溶于1×SDS-PAGE 上樣緩沖液中。
② 由于提取過程中使用了DTT，為了避免DTT對蛋白濃度測定的干擾，蛋白定量時盡量選擇Bradford方法。