真菌基因組DNA提取試劑盒（目錄號(hào)：RTG2407）
● 試劑盒內(nèi)容及保存：
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試劑盒組成
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RTG2407
（50次）
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貯存方式
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緩沖液C1
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40 ml
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常溫
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緩沖液C2
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12 ml
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常溫
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緩沖液C3
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20 ml
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常溫
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漂洗緩沖液WB1
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30 ml
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常溫
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DNA Wash
Buffer (濃縮液)
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13 ml
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常溫
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洗脫緩沖液EB
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15 ml
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常溫
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RNaseA
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220 μl
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-20℃
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吸附柱CG
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50個(gè)
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常溫
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收集管（2
ml）
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50個(gè)
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常溫
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說(shuō)明書(shū)
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1份
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● 儲(chǔ)存條件和效期：
室溫保存，24個(gè)月內(nèi)有效。Buffer C2于Buffer C3可能有沉淀產(chǎn)生，37℃水浴溶解后即可。RNase A常溫運(yùn)輸,-20℃保存。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
該試劑盒采用簡(jiǎn)便的硅膠柱結(jié)合純化方式和獨(dú)特的溶液處理系統(tǒng)，可在60分鐘內(nèi)可處理多個(gè)100mg新鮮或30mg干燥真菌組織樣品。獨(dú)特的緩沖液與硅膠柱可以有效的去除組織裂解物種的多糖，酚類(lèi)，以及酶抑制物。該試劑盒提取到的DNA可以用于PCR，Southern雜交，酶切消化等實(shí)驗(yàn)。無(wú)需使用酚氯仿等有機(jī)，可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的處理。
● 準(zhǔn)備工作：
1. 準(zhǔn)備65℃水?。粺o(wú)水乙醇；異丙醇；制冰機(jī)；1.5ml離心管；2ml離心管
2. 按照標(biāo)簽所示在漂洗緩沖液PW中加入無(wú)水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?
3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液R2，緩沖液R3是否有沉淀生成，如果出現(xiàn)沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。
● 標(biāo)準(zhǔn)操作步驟：
如非指出，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
1.樣品的處理：
A．新鮮樣品：新鮮樣品可以用液氮研磨成粉末?；蛘咴?5℃烘箱下過(guò)夜來(lái)干燥后按干燥樣品進(jìn)行操作。
B．干燥樣品：用研缽或研磨研杵研磨成粉末。
2. 小于100mg新鮮樣品或者小于20mg干燥樣品，加入600μl Buffer C1及4μl
RNase A渦旋混勻。
3.65℃水浴10分鐘。孵育過(guò)程中短暫渦旋管子幾次。
4. 加入150μl Buffer C2，顛倒振蕩混勻,冰上放置1分鐘后10,000×g下離心3min。 （離心后應(yīng)分層，如還有漂浮物，請(qǐng)延長(zhǎng)離心時(shí)間）。
5. 小心地把上清液吸至另一新的小離心管中。注意確保不要打散沉淀團(tuán)或把組織碎片也一起轉(zhuǎn)移。
6. 加入二分之一上清體積的 Buffer C3與與等體積的無(wú)水乙醇，充分混勻。如：向300μl
上清中加入150μl Buffer C3與300μl無(wú)水乙醇。
7. 把上述混勻的液體轉(zhuǎn)移到分離柱上。10,000×g離心1
min以結(jié)合DNA，棄去濾出液體。純化柱最大容量為750μl,如果混合液大于750μl,請(qǐng)分兩次過(guò)柱。
8. 將GBC吸附柱重新套回收集管中，加入600μl
DNA Wash Buffer（使用前須按要求用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)┲林又校?0,000×g離心1min,倒棄流出液；
9.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g離心1min,棄去流出液；
10. 將吸附柱重新套回2ml收集管中，最大轉(zhuǎn)速（>13.000xg）離心空結(jié)合柱1min以干燥柱子的基質(zhì)；這一步對(duì)下面的洗脫步驟至關(guān)重要。
12. 將柱子置于1.5ml滅菌離心管，加入50-150μl65℃預(yù)熱的T洗脫緩沖液EB至柱子的膜中央。室溫靜置5min；
13. 室溫下，離心(>13000g)1min，以洗脫DNA。保留含DNA的流出液。將DNA儲(chǔ)于-20℃。
對(duì)低DNA含量的樣品按如下操作：
1. 收集研磨成粉末的植物組織，新鮮組織約400mg（干燥組織約200mg），置樣品于15ml離心管中。
2. 加入9ml Buffer C1，劇烈地漩渦振蕩。
3.65℃水浴30-60min。水浴期間顛倒樣品數(shù)次。
4. 加入2.5ml Buffer C2，充分混勻，3000×g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清到新的15ml離心管中，加入0.7倍的異丙醇，3000×g離心10分鐘。
5. 倒掉上清，加入300μl的滅菌去離子水與5μl RNaseA。65℃水浴溶解DNA。
6. DNA完全溶解后，加入150μl Buffer C3與300μl無(wú)水乙醇。
7. 按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟的第七步，繼續(xù)往下操作。
● DNA濃度及純度檢測(cè)：
基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度?？膳渲?.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)， OD260/OD280比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。
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常見(jiàn)問(wèn)題
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可能原因
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建議
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堵柱子
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轉(zhuǎn)移裂解上清時(shí)，轉(zhuǎn)移了沉淀
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按說(shuō)明書(shū)操作，氯仿分離后，確保不轉(zhuǎn)移到沉淀
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樣品太粘稠
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樣品量別超過(guò)說(shuō)明書(shū)上所說(shuō)的，或者增加 Buffer C1 的用量。
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低濃度的DNA量
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樣品的破壁方式不對(duì)
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不論新鮮還是干燥樣品，在加入 Buffer C1 之前必須用適當(dāng)方式的研磨成粉末。
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樣品的裂解效果不好
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減少樣品量，或者增加Buffer C1的用量。
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DNA殘留在柱子上
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增加洗脫液的用量，并在離心洗脫前65℃孵育5min。
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DNA洗滌不當(dāng)
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DNA
Wash Buffer按說(shuō)明書(shū)用無(wú)水乙醇稀釋。
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下游應(yīng)用不好
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提取的DNA含鹽量高
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DNA
Wash Buffer如果必須按要求用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)仨毷覝胤胖谩?/span>
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提取的DNA含有乙醇
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洗脫前，必須最高轉(zhuǎn)速空甩柱
子1min。
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● 常見(jiàn)問(wèn)題分析：
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常見(jiàn)問(wèn)題
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可能原因
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建議
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沒(méi)有洗脫出DNA
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加入緩沖液R5后沒(méi)有加入無(wú)水乙醇
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樣品過(guò)柱前，必須用無(wú)水乙醇調(diào)整核酸結(jié)合條件，否則核酸不能掛柱。
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漂洗緩沖液WB2中沒(méi)有加入乙醇
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漂洗緩沖液WB2使用前請(qǐng)按照標(biāo)簽加入無(wú)水乙醇。無(wú)水乙醇加入量不正確會(huì)導(dǎo)致核酸提取量大大降低。
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低濃度的DNA量
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緩沖液R2使用過(guò)量
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按照步驟1加入適量緩沖液R2
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洗脫體積太小
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洗脫體積不能低于50μl，如洗脫體積太小，回收率將大大降低。
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洗滌不恰當(dāng)
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漂洗緩沖液PW使用前請(qǐng)按照標(biāo)簽加入無(wú)水乙醇。無(wú)水乙醇加入量不正確會(huì)導(dǎo)致核酸提取量大大降低。
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低A260/A280比率
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蛋白污染
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不要忽略步驟8中用漂洗緩沖液WB1沖洗吸附柱
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洗脫液pH值不合適
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確保使用的洗脫液pH在8.0以上，如低于8.0將導(dǎo)致DNA洗脫量過(guò)低。
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下游應(yīng)用不好
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提取的DNA含鹽量高
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漂洗緩沖液WB2使用前請(qǐng)按照標(biāo)簽加入無(wú)水乙醇。
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提取的DNA含有乙醇
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步驟11空甩柱子2分鐘非常關(guān)鍵，徹底去除漂洗液中的乙醇。
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抑制PCR反應(yīng)
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增加緩沖液R2用量，徹底去除腐殖酸等PCR抑制因子；步驟4中確保不要吸取到沉淀。
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RTG2407 真菌基因組DNA提取試劑盒發(fā)表文章
1. [2021 IF=6.064] Genome resequencing and transcriptome
analysis reveal the molecular mechanism of albinism in Cordyceps militaris.
Author: Ying Zhao, YuDong Liu, Xun Chen and Jun
Xiao
Product: RTG2407 真菌基因組DNA提取試劑盒
Journal: Fronties in
Microbiology. Published 11 April 2023
Institution： Institute of Edible Fungi, Liaoning
Academy of Agricultural Sciences
Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1153153/full