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10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液

10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液

產(chǎn)品編號(hào):BC600P

產(chǎn)品規(guī)格:1升

數(shù)量
價(jià)格 ¥300


10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液

產(chǎn)品編號(hào)

產(chǎn)品名稱(chēng)

規(guī)格

BC600P

10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液(粉末)

1

簡(jiǎn)介:

10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液(10×Blue Native Transfer Buffer適用于BN蛋白電泳后凝膠上非變性蛋白的轉(zhuǎn)膜。本轉(zhuǎn)膜液配制便捷,稀釋后無(wú)需調(diào)節(jié)pH值,pH約為7.5-7.7。該緩沖液最終可配成10升即用型1×緩沖液(根據(jù)需求補(bǔ)加甲醇)。

保存和運(yùn)輸:

粉末裝常溫保存,常溫運(yùn)輸,兩年有效;配成10×轉(zhuǎn)膜緩沖液后4℃貯存,一年有效;加入甲醇的即用型轉(zhuǎn)膜緩沖液4℃貯存,一個(gè)月有效。

配制方法:

10×轉(zhuǎn)膜緩沖液粉末全部溶解于1升超純水中,徹底溶解,即配成10×轉(zhuǎn)膜緩沖液。

根據(jù)下表配制成1×即用型轉(zhuǎn)膜緩沖液

 

1×即用型轉(zhuǎn)膜緩沖液

 

500 ml

1 L

2 L

10×轉(zhuǎn)膜緩沖液

50 ml

100 ml

200 ml

無(wú)水甲醇

甲醇終濃度0-20%

超純水

定容至 500 ml

定容至 1

定容至 2

 

不要調(diào)節(jié)pH

注:轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入甲醇對(duì)蛋白有固定作用,轉(zhuǎn)膜分子量較大的蛋白少加或不加甲醇,轉(zhuǎn)膜分子量較小的蛋白要加至多20%的甲醇。非變性蛋白的轉(zhuǎn)膜可以不加甲醇。

使用方法:

1. BN電泳介紹:

Blue Native PAGE(BN-PAGE)是一種從生物樣品(質(zhì)膜,胞漿等)中分離分子量10 kD-10 M kD 范圍的蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳技術(shù)。其原理是用溫和去污劑(如 DDM,digitonin)將蛋白復(fù)合體從細(xì)胞膜中以近似天然的狀態(tài)分離出來(lái),Blue Native PAGE (BN-PAGE)是用考馬斯亮藍(lán) G-250 代替 SDS與蛋白結(jié)合而使其帶負(fù)電荷,根據(jù)蛋白分子量不同在 PAGE膠中得到分離。BN-PAGE由于考馬斯亮藍(lán)G-250存在,使蛋白都覆蓋上負(fù)電荷,可以分離堿性蛋白(pI>7)。BN電泳可以選擇Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(U型板3-12%預(yù)制膠,通用型)(貨號(hào):RTD6139-0312或RTD6139-0416)

2. 電泳后凝膠預(yù)處理(可選步驟):

凝膠浸泡于適量1×即用型BN轉(zhuǎn)膜緩沖液(加終濃度0.1% SDS)中,搖床慢搖10分鐘。

注:凝膠浸泡在含SDS緩沖液中,能讓蛋白帶上更多的負(fù)電荷,有利于蛋白的轉(zhuǎn)膜。

3. 轉(zhuǎn)膜:

3.1轉(zhuǎn)膜方法:BN電泳后的轉(zhuǎn)膜建議用濕轉(zhuǎn)法。

3.2膜的選擇:BN電泳轉(zhuǎn)膜必須使用PVDF膜,不能用NC(NC膜會(huì)與考馬斯亮藍(lán)G-250不可逆結(jié)合,很難清除干凈)。根據(jù)蛋白大小選擇膜的孔徑。一般說(shuō)來(lái),大于20 kD蛋白選擇0.45 μm孔徑,低于20 kD選擇0.22 μm孔徑。PVDF膜使用前要用無(wú)水甲醇潤(rùn)濕活化。

3.3 三明治結(jié)構(gòu):轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)膜相同,即根據(jù)“黑膠白膜”制作三明治,即膜置于轉(zhuǎn)膜夾芯正極一側(cè),凝膠置于轉(zhuǎn)膜夾芯負(fù)極一側(cè),這樣凝膠上帶負(fù)電荷的蛋白才能轉(zhuǎn)移到膜上。

蛋白轉(zhuǎn)膜三明治制作:

負(fù)極(電轉(zhuǎn)夾黑色面)-海綿墊-11 mm厚度濾紙-凝膠--11 mm厚度濾紙-海綿墊-

極(電轉(zhuǎn)夾白色面)



3.4 轉(zhuǎn)膜條件:

由于在非變性條件下,不同蛋白的空間結(jié)構(gòu),聚合狀態(tài),電荷數(shù)量都有不同,以下轉(zhuǎn)膜條件僅供參考,客戶(hù)針對(duì)自己的目的蛋白,最好經(jīng)過(guò)1-2次預(yù)實(shí)驗(yàn)后,確定最佳的轉(zhuǎn)膜條件。

蛋白大小

穩(wěn)流

建議時(shí)間

降溫措施

低于70kD

150 mA

1 小時(shí)

不需要

70-300 kD

200 mA

1.5-2 小時(shí)

需要

高于300 kD

200 mA

2.5-3.5 小時(shí)

需要

4. 洗膜:

PVDF膜用無(wú)水甲醇清洗10分鐘,徹底去除藍(lán)色G250。

5. 進(jìn)行后續(xù)WB操作:封閉-一抗-二抗-檢測(cè)。




 
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